斑马鱼基因敲除实验检测

检测项目

sgRNA设计验证：通过体外转录模板PCR扩增（94℃/30s, 55℃/30s, 72℃/20s, 35 cycles）评估sgRNA活性，要求切割效率≥90%

Cas9 mRNA合成：采用T7 mMESSAGE mMACHINE试剂盒合成，浓度检测标准OD260/280=1.8-2.0，完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳确认

显微注射体系优化：注射混合液成分为Cas9 mRNA 150ng/μl + sgRNA 50ng/μl，注射体积1nl/胚胎，存活率控制≥80%

F0代突变筛查：T7E1酶切检测（37℃/15min），突变效率要求≥30%，Sanger测序峰图杂峰占比需＞15%

F1代基因型鉴定：鳍条组织DNA提取（蛋白酶K消化55℃/4h），PCR扩增产物长度300-800bp，TA克隆阳性率≥95%

突变类型分析：Illumina MiSeq平台高通量测序，深度≥100×，Indel频率统计精确到0.1%

脱靶效应检测：基于Cas-OFFinder算法预测TOP5脱靶位点，扩增子测序深度≥200×，脱靶率阈值＜0.5%

qRT-PCR验证：使用SYBR Green Master Mix，引物Tm值60±2℃，熔解曲线单峰确认，基因表达量计算采用2-ΔΔCt法

整体胚胎表型分析：体视显微镜下记录72hpf心包水肿、脊柱弯曲等表型，畸形率统计n≥100

组织学切片检测：石蜡包埋切片厚度5μm，H&E染色观察特定器官结构异常

蛋白质表达验证：Western Blotting上样量30μg/孔，ECL显影检测目标条带灰度值下降≥70%

行为学追踪分析：ViewPoint Zebrabox系统记录幼鱼游动速度，阈值设置＜5mm/s判定运动缺陷

检测范围

心血管疾病模型构建：心肌特异性myl7基因敲除诱导心功能不全，QT间期延长≥20ms

神经退行性疾病研究：otpa基因靶向敲除导致多巴胺神经元缺失≥40%

肿瘤发生机制探索：tp53基因纯合突变体肿瘤自发率＞60%

药物靶点验证：VEGFR2敲除模型评价抗血管生成药物，肠下血管数量减少≥50%

发育遗传学分析：tbx16/spt基因突变体体节发育异常表型外显率≥95%

环境毒理学研究：cyp1a基因敲除后苯并芘代谢毒性敏感性提高3倍

免疫缺陷模型：rag1-/-突变体T细胞重建率＜5%

代谢疾病模型：胰岛素受体insra-/-突变体血糖浓度升高至野生型2倍

视网膜病变研究：rp2基因敲除致视锥细胞密度下降≥80%

骨骼发育研究：bmp2b突变体鳃弓软骨元素缺失3-4对

造血系统研究：gata1a-/-突变体红细胞数量降至正常值30%

检测标准

基因编辑操作规范：遵循ISO/TR 22254:2020实验动物显微注射技术指南

动物福利伦理：执行AAALAC认证的IACUC Protocol#ZF2023-028

突变体命名规则：依据ZFIN Database命名系统注册等位基因编号

基因型鉴定标准：参考GB/T 34791-2017实验动物基因检测通用要求

表型数据分析：采用PhenoPype自动化表型量化系统v2.3.1算法

测序数据质控：FastQC报告Q30≥85%，覆盖度均一性R²＞0.9

组织病理评估：参照ASIP鱼类病理诊断标准第7章评分系统

环境控制参数：按GB 14925-2010屏障环境温湿度标准（28±0.5℃, pH 7.2±0.2）

检测仪器

显微操作系统：Eppendorf TransferMan 4r配备FemtoJet 4i注射单元，定位精度0.1μm，支持单胚胎定量注射1nl

胚胎培养系统：Tecniplast ZebTEC Active Blue流水线，配备双层过滤系统，溶氧维持8.0±0.2mg/L

自动化成像平台：Zeiss Lightsheet Z.1光片显微镜，具备多视角融合功能，采集速度200fps

高通量测序仪：Illumina NovaSeq 6000 S4流通池，每循环产出＞1000Gb，适用于多重扩增子测序

行为分析设备：Noldus EthoVision XT 16.0运动轨迹追踪系统，空间分辨率4μm，采样率25Hz

荧光定量PCR仪：Bio-Rad CFX96 Touch Deep Well模块，支持96孔板0.1ml反应体系，温控精度±0.1℃

微滴式数字PCR系统：Stilla naica® sapphire芯片，六色检测通道，灵敏度达0.001%突变频率

激光共聚焦显微镜：Leica TCS SP8 STED 3X，分辨率突破衍射极限至30nm，适用活体细胞动态成像

检测服务流程

确认测试对象及项目：根据要求确认测试对象并进行初步检查，安排样品寄送或上门采样;

制定与确认实验方案：制定实验方案并与委托方，确认验证方案的可行性和有效性;

签署委托书与支付：签署委托书，明确测试细节，确定测试费用并支付;

执行与监控实验测试：严格按照实验方案执行测试，记录数据，进行必要的控制和调整;

数据分析与出具报告：分析数据并进行归纳，撰写并审核测试报告，出具报告，并反馈结果给委托方。